ГЛАВА 59. ОНКОГЕНЫ И НЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Поль Нейман (Paul Neiman)

При дробленьи раковые клетки передают дочерним клеткам неопластический фенотип. Но этой причине получило всеобщее распространение воззренье о том, что наследование неопластического фенотипа предопределяется специфическими генами. Это предположение поясняет чрезвычайный интерес исследователей-онкологов к онкогенным вирусам. Несмотря на сравнительную генетическую простоту, они вызывают все патологические и клинические изменения, ассоцииро­ванные с неопластическим заболеванием, и в некоторых случаях вирус способен вводить в нормальную клетку единственный ген (онкоген), продукт которого инициирует и поддерживает неопластическое состояние. Онкогены представляют собой измененные формы клеточных протоонкогенов, которые в норме выпол­няют в клетке главные функции. Человеческие гомологи некоторых из этих онкогенов могут играть определенную роль в раковых заболеваниях человека. Эта ситуация поднимает ряд вопросов условно природы онкогенов, управ­ления их экспрессией, биохимической природы их генных продуктов и механизмов взаимодействия с метаболизмом клетки-владельца.

Ретровирусные онкогены. Взаимодействие ретровирусов с клеткой-владельцем. Открытие онкогенов появилось результатом изуче­ния молекулярной биологии РНК опухолевых вирусов (ретровирусов). Ретро-вирусы широко распространены в природе и инфицирование некоторыми из них ассоциируется с новообразованиями у животных; иные же опухолегенными свойствами не владеют. Геном ретровируса представляет собой молекулу РНК длиной от 8000 до 10000 нуклеотидов. Характерной необыкновенностью жизненного цикла ретровирусов является то обстоятельство, что после проникновения вируса в клетку геномная молекула РНК копируется на ДНК (обратная транс­крипция), и ДНК-копия интегрируется с хромосомной ДНК клетки-владельца (отсюда и название ретровирус) (рис. 59-1). Эта интегрированная ДНК назы­вается провирусом. Структура типичных провирусов схематически изображена на рис. 59-2. Длинные терминальные повторы (ДТП) содержат последователь­ности, скопированные с обоих концов геномной РНК вируса, размещены на каждом конце ДНК провируса н сцеплены непосредственно с ДНК владельца. ДТП содержат последовательности, регулирующие экспрессию генов при репли­кации вирусов: gag кодирует внутренние структурные белки, pol— обратную транскрнптазу, env — гликопротеин вирусной оболочки. В регуляторные после­довательности включены сигналы инициации и терминации транскрипции. Обыч­но они содержат также могучий ген-усилитель, способный настолько повысить темп транскрипции вирусных генов, что провирусный РНК-транскрипт будет сочинять от 0,1 до 1% полного клеточного содержания мРНК. Промоторы и усилители транскрипции обычно включаются лишь в клетках определенного типа, чем и определяется тканеспецифичность вирусных генов. В иных случаях активность последовательностей-усилителей реализуется стероидными гормонами. В отличие от многих иных вирусов ретровирусы обычно не приводят клетку-владельца к погибели после завершения репликации; вместо этого они встраиваются в экзогены, вызывают их экспрессию и тем самым меняют фенотип клетки-владельца.

Рис. 59-1. Репликация ретровирусов.

(1) Оболочечный гликопротеин на поверхности вирусных частиц (вирионов) распознаёт рецепторы, способствующие входу в клетку, и освобождает вирусную геномную РНК.

(2) Каждый вирион содержит две молекулы вирусной РНК, которые в клетке копи­руются обратной транскриптазой в циклические скрученные молекулы вирусной ДНК.

(3) Некоторые из циклических молекул ДНК встраиваются в хромосомную ДНК владельца в требовательно определенных точках молекулы вирусной ДНК и в случайном, или почти слу­чайном, сайте хромосомы владельца. (4) Интегрированная копия вирусной ДНК, или провирус, транскрибируе-тся как в мРНК, которая транслируется на клеточных полисо­мах в вирусные белки (5), так и в полимерную геномную вирусную РНК, которая содержит специфические последовательности, служащие сигналами упаковки при сборке вируса. (6) Вирусные РНК и белки собираются в частицы, которые затем покидают клетку. Весь процесс может не сопровождаться цитопатическими эффектами для клетки владельца.

Остротрансформирующие ретровирусы и их онкогены. Заражение животных ретровирусами, содержащими только гены gag, pol и env, сопровождается новообразованиями лишь после длинного латентного периода. Против, остротрансформирующие ретровирусы в считанные дни или недели могут вызвать неоплазию in vivo или привести к перерождению клеток в культуре in vitro. Прототипом этого класса вирусов служит вирус саркомы Рауса. Структура провирусов из этих двух классов онкогенных агентов при­ведена на рис. 59-2. Почти все знаменитые остротрансформирующие ретровирусы дефективны, т. е. они утратили часть генов, необходимых для репликации, и, следовательно, их распространение вероятно лишь маршрутом коинфекции со стандартными ретровирусами-хелперами. Такие дефекты являются результатом замещения репликативных генов вируса на онкоген, который играет роль по­средника для. непосредственно трансформирующих свойств вируса. Исключения из этого общего верховодила представлены некоторыми штаммами вируса саркомы Рауса, которые имеют как репликативные гены, так и онкогены. Желая конкрет­ный сегмент вирусного генома, который замещается на онкоген, может варьиро­вать, общая конфигурация остротрансформирующих вирусов такова, как это показано на рис. 59-2. В этом случае онкоген спаян с 5`-областью вирусного гена gag, в результате чего синтезируется трансформирующий белок с пептидами gag в аминотерминале.

В табл. 59-1 приводится список некоторых вирусов онкогенов, их естественных владельцев и типов опухолей, которые они вызывают. В случае вируса саркомы Рауса роль гена src в неопластических трансформациях была установлена средствами генетики и биохимии. Знамениты мутации, вызывающие обратимую инактивацию продуктов гена src при повышении температуры (так нарекаемые температурочувствительные мутации). Эти мутации переводят трансформиро­ванный фенотип в нормальное состояние, если инфицированные клетки под­вергаются воздействию повышенной температуры. При понижении температуры клетки снова возвращаются в трансформированное состояние. Подобные, желая и не столь полные, данные получены и для иных вирусов, перечисленных в табл. 59-1.

Рис. 59-2. Сравнительные структуры провирусов со стандартной компетентной репликацией и остро трансформирующих ретровирусов. В обоих случаях провирус окаймлен прямыми последовательностями длинных терми­нальных повторов (ДТП), которые содержат главные элементы регуляции: включая промоторы и усилители транскрипции, сигналы терминации транскриптов вирусной РНК (сигналы добавки поли-А) и сигналы интеграции в ДНК владельца. Между ДТП стандартного ретровируса находятся три гена: gag (внутренние структурные белки), pol (обратная транскриптаза) и env (гликопротеин оболочки), которые необходимы для инфекции и репликации. У остротрансформирующих вирусов все или часть репли­кативных генов замещены трансформирующим онкогеном, который и определяет онкогенные свойства вируса. Наиболее общей структурой является спайка 5-участка гена gag с онкогеном. Стандартный провирус транскрибируется в полномерную вирусную РНК и в мРНК для синтеза вирусных белков. Остротрансформирующий провирус часто экспрессирует только один сайт РНК-транскрипта. В этом случае репликация дефек­тивна и для размножения требуется коинфекция со стандартным ретровирусным «хелпером». Символ Agag значит, что часть последовательности gag исчезла в резуль­тате делеции.

Почти все трансформирующие вирусы могут быть обнаружены in vitro по их способности вызывать перерождение клеток в культуре. Стандартный тест со­стоит в формировании инфицированными фибробластами (или чертами фибробластоподобных клеток) морфологически измененных клеток. Некоторые из по­рождающих лейкемию вирусов могут трансформировать макрофаги и/или кроветворные клетки in vitro.

Протоонкогены.Онкогены ретровирусов находятся в недалёком родстве с нор­мальными генами клеток. Это родство было установлено в результате открытия гомологичности в нуклеотидных последовательностях трансформирующего онкогена вируса саркомы Рауса v-src (вирусного src) и нормального гена цыпленка с-сгс (клеточного src). Явно, вирус саркомы Рауса появился результатом рекомбинаций между c-src и древним стандартным ретровирусом птиц. Такой механизм — рекомбинация между вирусным геном и геном владельца — служит явным изъяснением образования трансформирующих вирусов (см. табл. 59-1). По этой причине функции нормальных генов и их роль в невирусных ново­образованиях вызывают повышенный интерес исследователей.

В природе нормальные формы онкогенов весьма консервативны. Для каж­дого из них существуют человеческие гомологи, а гомологи некоторых из них присутствуют во всех эукариотических организмах, до беспозвоночных и дрож­жей включительно. Такой консерватизм наводит на мысль, что эти гены вы­полняют в нормальных клетках жизненно главные функции, и предполагает, что онкогенный потенциал приобретается генами только после функционально означаемых изменений (таких, например, какие происходят при рекомбинации с ретровирусом). О таких генах разговаривают как о протоонкогенах (с-оnс).

Таблица 59-1. Вирусные онкогены, вызывающие острые трансформации

Нуклеотидные последовательности белков кодирующих областей вирусных онкогенов отличаются от таковых для протоонкогенов. Существуют также прин­ципиальные различия в регуляции экспрессии вирусных и клеточных генов. Например, нормальные клеточные формы онкогена могут экспрессироваться без трансформации клетки, желая обычно экспрессия протекает на более низком уровне, и/или с более жесткой регуляцией, чем .для вирусных онкогенов, экспрессируемых провирусами. Условные вклады сверхэкспрессии, измененной регуляции и структурных мутаций в трансформирующую активность вирусных онкогенов не вполне светлы. Все эти элементы могут владеть той или иной ступенью важности в зависимости от конкретного онкогена и типа клетки-мишени.

Инфицирование ретровирусами, не содержащими онкогенов, может вызвать новообразования у некоторых животных, но после длинного латентного периода. Общим механизмом такой онкогенной активности является активация клеточных протоонкогенов, на что указывает образование лимфом в фабрициевой сумке цыплят, зараженных вирусом лейкоза птиц (ВЛП). При этих новообра­зованиях протоонкоген, нарекаемый с-тус, экспрессируется с высоким уровнем в результате интеграции промотора-усилителя ВЛП-генома вблизи с-mус. Тот факт, что эти опухоли клонируются и активация с-тус наблюдается только в опухолевых клетках, вкупе с знаменитым онкогенным потенциалом v-myc под­тверждает идею- о том, что с-тус играет главную роль в образовании этих опухолей. В табл. 59-2 приведен список протоонкогенов, о которых знаменито, что они активируются в порождаемых ретровирусом опухолях с великим ла­тентным периодом. Некоторые из-них (myc, erb В) гомологичны знаменитым вирусным онкогенам. Иные (Int-1, Int-2, Pim-1, Mlvi-1, Mlvi-2) не иденти­фицированы как доли геномов остротрансформирующих вирусов. Их онкоген­ный потенциал выводится по аллелям.

Таблица 59-2. Протоонкогены и предполагаемые протоонкогены, активирующиеся в опухолях маршрутом интеграции с ретровирусными провирусами

Ретровирусы человека.Вирусы лейкоза Т-клеток человека (HTLV) являются ретровирусами, реплицирующимися предпочтительно в лимфоцитах человека. Инфицирование HTLV типа I ассоциировано с развитием специфического типа лейкемии Т-клеток у взрослых, которая с нарастающей частотой встречается в южной Японии и странах Карибского бассейна. Инфицирование in vitro штаммом HTLV-I культуры Т-клеток человека подтверждает способность вы­зывать рост самостоятельно от экзогенных факторов роста Т-клеток (иммортализация). Инфицирование иным вирусом, нарекаемым HTLV-III, ассоциируется с синдромом приобретенного иммунодефицита. То же самое правосудно для вируса LAV, ранее ассоциированного с лимфаденопатией. По-видимому, HTLV не содержат клеточно-зависимых онкогенов. Вместо этого они меняют поведение клетки-владельца уникально взаимодействующими вирусными регуляторными бел­ками.

Нормальная человеческая ДНК содержит структуры, которые могут оказать­ся провирусами и генетически передаются половыми клетками. Значимость таких структур неизвестна.

Активированные клеточные онкогены, детектируемые трансфекцией.Трансфекционный тест на онкогены. Некоторые из знаменитых клеточных линий владеют способностью инкорпорировать экзогенную ДНК в свой хромо­сомный аппарат с такой эффективностью, что появляется возможность экспе­риментального введения гена (трансфекции) непосредственно в культуру тканей. Технология трансфекции обычно содержится в осаждении ДНК на поверх­ность клеток-мишеней фосфатом кальция с последующим поглощением ДНК внутрь клетки посредством пиноцитоза. Некоторые из поглощенных молекул ДНК транспортируются в клеточное ядро и интегрируются в хромосомную ДНК. Если трансфектированная ДНК содержит ген, который может экспрессироваться в клетке-реципиенте как доминантный селектируемый маркер, то клетки, экснрессирующие этот признак, могут быть обнаружены в культуре с эффектив­ностью до одной клетки на каждые 10⁵ событий трансфекции. Многие из вирусных онкогенов. (см. табл. 59-1) могут вызвать трансформации в тестах описан­ного типа. Трансформация такого рода имеет место как при использовании чистой онкогенной ДНК, так и при использовании хромосомной ДНК клеток, трансформированных ретровирусами.

Таблица 59-3. Онкогены, обнаруженные в опухолях человека трансфекцией клеток NiH/3ТЗ