РАЗДЕЛ 1. НАРУШЕНИЯ РАЗМЕНА ВЕЩЕСТВ
ГЛАВА 305. ВРОЖДЕННЫЕ НАРУШЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА (ОБЗОР)
Леон Ею Розенберг (Дущт У. Кщыутиукп)
Взаимодействие генов и окружающей среды.Под понятием «обмен веществ» разумеют все процессы образования (анаболизм) и разрушения (катаболизм) живой материи. Они начинаются с самых ранних химических реакций, приводящих к образованию сперматозоида и яйцеклетки, длятся в периоды оплодотворения, роста, созревания и старения и неминуемо кончаются лишь со смертью клетки, ткани, органа и, наконец, особи. Процессы метаболизма контролируются двумя взаимодействующими факторами: генами, определяющими потенциальные возможности любой клетки (и, следовательно, любого организма), и окружающей средой, диктующей характер экспрессии этих генов. Отсюда следует, что все метаболические расстройства обусловлены нарушением взаимодействия между генами и факторами окружающей среды или, взыскательно разговаривая, что ни одно из этих расстройств не может считаться чисто врожденным или чисто приобретенным. Когда мы почти ничего не знаем о генетических детерминантах хвори (как, например, о предрасположенности к туберкулезу или травматическим переломам костей), то разглядываем ее как приобретенную. И, наоборот, когда нарушение размена обусловлено основным образом недостатком специфического белка (и, следовательно, мутацией специфического гена) и когда это нарушение наследуется как простой менделевский признак (например, острая интермиттирующая порфирия или фенилкетонурия), мы считаем его наследственным. На самом же деле ни острая интермиттирующая порфирия, ни фенилкетонурия не приобретут клинического значения, не будучи спровоцированными или модифицированными факторами окружающей среды (лечебные вещества и гормоны при порфирии, пищевой фенилаланин при фенилкетонурии). Осознание этой неразделимости роли генов и окружающей среды главно не только с нозологических позиций. Идентификация генов, контролирующих предрасположенность к туберкулезу, позволила бы выделять отдельных лиц и целые их контингенты в группы риска, а дополнительное выяснение зависимости пищевой потребности в фенилаланине от возраста позволило бы разработать более эффективные диетические подходы к лечению больных с фенилкетонурией.
Характер врожденных недостатков. Внастоящее время знаменито несколько тысяч потомственных нарушений размена веществ, или, как их впервые назвал Garrod, врожденных ошибокметаболизма, причем скоро появляются известия о новых их видах. В совокупности эти состояния затрагивают все фазы метаболизма, что вносит великой вклад в понимание нормальных путей метаболизма. Для всех них отличительны лишь две упомянутые общие черты: любое из них наследуется как простой менделевский признак и обусловлено в окончательном счете функциональной неполноценностью специфического белка. Во всех иных отношениях это совершенно различные состояния. Большинство из них наследуется как аутосомный рецессивный признак; это значит, что для фенотипического проявления расстройства необходима двойная доза мутантного гена (см. гл.57). Иные наследуются как сцепленные с Х-хромосомой или аутосомно-доминантные признаки. Частота некоторых достигает 1:500 (семейная гиперхолестеринемия), тогда как иные встречаются с частотой всего лишь 1:1000000 (алкаптонурия). Часть из этих состояний четко концентрируется среди представителей отдельных рас или этнических групп (серповидно-клеточная анемия, талассемия, хворь Тея —Сакса), иные распределяются между расами и этническими группами, по-видимому, равномерно. Некоторые из них проявляются клинически при рождении (или даже раньше), иные —только в зрелые годы (или вообще не проявляются). Одни наверняка смертельны, несмотря на лечение, иные не влияют на продолжительность жизни и здоровье человека.
Уровень понимания. Поскольку клинические и биохимические аномалии при этом потомственном заболевании размена веществ отражают мутацию специфического гена, каждую врожденную «ошибку» теоретически можно разглядывать на четырех уровнях: гена, белка, кодируемого этим геном, той метаболической реакции, на которой «работает» этот белок, и клинического или биохимического фенотипа, обусловленного нарушением этой реакции. Ряд заболеваний, связанных с нарушением синтеза полипептидной цепи глобина (талассемии и гемоглобинопатии), выучены на всех этих уровнях (см. гл.288). Например, выяснено, что при хвори гемоглобина S (серповидно-клеточная анемия) изменяются специфические нуклеотидные основания в структурном гене р-глобина и точная аминокислотная замена в полипептидной цепи р-глобина. Далее, результаты физико-химических исследований гемоглобина S показали, почему этот мутантный белок в деоксигенированном состоянии приобретает способность к образованию геля и формирует сгустки, нарушающие форму эритроцита и обусловливающие повышение вязкости крови, образование в ней тромбов, инфаркт тканей и гемолиз, отличительные для этого заболевания. До недавнего медли сведения на уровне генов имелись только в отношении нарушения синтеза полипептидной цепи глобина. Разработка методики рекомбинации ДНК резко увеличила количество клонируемых и выделенных генов человека (см. гл.58), а также число потомственных хворей, расшифрованных на генном уровне. В этот список включены в истиннее время локусы, кодирующие такие белки, как ai-антитрипсин, синтетаза аргининсукцината, коллаген, гормон роста, гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза, инсулин, орнитинтранскарбамилаза и гидроксилаза фенилаланина. Для многих локусов, однако, понимание застопорилось на уровне продукта гена, и даже в этом случае оно неполно. Например, при классической форме галактоземии резко снижена активность галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы; эта недостаточность приводит к накоплению галактозы и галактозо-1-фосфата, что сопровождается серьезными нарушениями функций печени и центральной сердитой системы. В то же время малюсенько знаменито о молекулярных основах недостаточности трансферазы или о тех механизмах, посредством которых накопление метаболита приводит к циррозу печени и отставанию психического развития. В иных случаях, например при хвори Уилсона или цистинозе, неведомо даже, функция какого конкретного белка нарушена, желая показано, что в тканях больного накапливаются соответственно медь и цистин. При хвори Гентингтона мы все еще не располагаем биохимическими средствами решения терапевтических, диагностических и прогностических проблем, желая генетический маркер этого заболевания идентифицирован (см. гл.58).
Белки как продукты генов
Спектр мутантных белков.Гены и информационные РНК представляют собой полимеры нуклеиновых кислот, часто нарекаемые информационными макромолекулами. По той же логике белки и полипептиды могут быть названы функциональными макромолекулами. Эти полимеры аминокислот превращают информационный потенциал генов и их посредников в химическую и физиологическую работу. Белки вездесущи. Они являются живыми компонентами мембран, делящих ткани, клетки и органеллы. В крови, лимфе и спинномозговой жидкости они поддерживают осмотическое давление и избирательно связывают и транспортируют громадное число маленьких молекул. В качестве ферментов и гормонов (вне клетки или в ней) они катализируют или регулируют реакции, определяющие возможность протекания анаболических и катаболических процессов. Белки почти бесконечно разнородны по размеру, форме и функции. Их условная молекулярная масса колеблется от нескольких сотен (гипоталамические рилизинг-факторы) до более миллиона (гамма-макроглобулина). Одни представляют собой мономеры, иные — олигомеры, состоящие из двух, трех, четырех или более сходных или разных полипептидных цепей. Одни имеют глобулярную форму, иные спиральную, третьи владеют как глобулярными, так и спиральными участками. Некоторые белки в качестве простетических групп или кофакторов содержат ионы металлов, тогда как для активности иных необходимы органические соединения. Каждый белок, однако, должен своими структурными необыкновенностями и функциональной специфичностью единственной причине — первичной аминокислотной последовательности. Поскольку она в свою очередь зависит от нуклеотидной последовательности гена и информационной РНК, кодирующей полипептид, наследуемые необыкновенности структуры или функции белка служат наглядным проявлением мутации гена. Мутации происходят во всех генах, и, следовательно, все белки могут подвергаться изменениям. Некоторые варианты этих изменений выявляются легко, так как они обусловливают явные биохимические или клинические нарушения. Обнаружение иных сопряжено с великими трудностями либо потому, что они обусловливают раннюю летальность, либо из-за их клинической или биохимической латентности.
Вообще разговаривая, мутации, определяющие потомственные метаболические нарушения, затрагивают структурные гены, кодирующие первичную структуру белка (см. гл.57). Изменения одного кодона обычно обусловливают замену одной аминокислоты и обозначаются как «меняющие смысл» мутации. Мутации в иных точках (приводящие к ошибочному расположению кодонов-терминаторов), одинаково как делеции и вставки (кодонов, генных сегментов или целых генов), обусловливают полное неименье продукта гена или появление столь неполного или искаженного продукта, что это практически лишает его функции. В иных случаях мутации могут изменять скорость продукции белка. Сходственный эффект может исполняться за счет либо модификации гена, контролирующего скорость синтеза белка, либо такого изменения кодонов структурных генов, которое приведет к ускорению или замедлению транскрипции или трансляции. Наконец, мутации могут определять посттрансляционную модификацию белков. Поскольку большинство белков, предназначенных для секреции, встраивания в мембрану или для транспорта в клеточные органеллы (лизосомы или митохондрии), синтезируется в виде предшественников, которые «по дороге к месту назначения» обязаны подвергаться процессингу, созреванию или гликозилированию, мутации могут изменять этот процесс. Образцами нарушения процессинга секреторных и лизосомных белков соответственно служат гиперпроинсулинемия и I-клеточная хворь.
Врожденные «ошибки» описаны для белков всех типов. Первыми обратили на себя внимание ферментные нарушения, блокирующие какую-либо анаболическую или катаболическую реакцию. Знамениты сотни образцов такого рода нарушений (см. следующие главы), да и в истиннее время в год раскрывают примерно 10 новых ферментных дефицитов. Врожденные «ошибки» транспорта, затрагивающие кишечник или почки, могут приводить к избирательному нарушению трансмембранного перемещения Сахаров, аминокислот, фосфата, витаминов или воды (см. гл.308). Такие нарушения, как цистинурия или глюкозурия, отражают недостаточность специфических мембранных белков-переносчиков, необходимых для трансэпителиального перемещения двухосновных аминокислот или глюкозы соответственно. Иные аномалии транспорта приводят к нарушению связывания гормонов с мембранными рецепторами (при резистентном к вазопрессину несахарном диабете) или иным нарушениям комплексирования белков с лигандами (при патологии поверхностных рецепторов липопротеинов низкой плотности у больного с семейной гиперхолестеринемией; см. гл.315). Мутации могут затрагивать и циркулирующие белки, а не только мембранные или внутриклеточные. Образцами таких состояний служат анальбуминемия, недостаточность транскобаламина II и абеталипопротеинемия.
Функциональные нарушения.Повышенная активность. Попросту разговаривая, метаболические нарушения могут считаться следствием слишком великого или слишком малого количества (или активности) специфического белка. Описаны вариантные формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД), псевдохолинэстеразы и фосфорибозилпирофосфатсинтетазы, владеющие повышенной активностью. В этих случаях мутации приводят к увеличению содержания внутриклеточного фермента за счет либо ускоренного синтеза мутантного белка, либо его замедленного распада. При острой интермиттирующей порфирии и семейной гиперхолестеринемии увеличивается также количество ферментов, катализирующих скоростьограничивающие реакции (см. гл.312 и 315). Однако в заключительном случае чрезмерная активность фермента представляет собой вторичный феномен, обусловленный нарушением регуляции по механизму обратной связи, а это нарушение связано с иным первичным генетическим недостатком.
Сниженная активность. В основе большинства врожденных нарушений размена веществ лежит сниженная активность (или убавление количества) белка. Эта недостаточность может быть полной (при классических формах фенилкетонурии и галактоземии) или частичной (при высококачественных вариантах этих нарушений). Следует подчеркнуть, что полную потерю активности фермента нельзя отождествлять с полным неимением белка. Например, при классической галактоземии в тканях больного не удается обнаружить активности галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы, желая в тех же тканях содержится белок, перекрестно реагирующий с антителами к нативной молекуле трансферазы. Можно привести многочисленные образцы патологических состояний, при которых определяется перекрестно реагирующий материал (состояния, позитивные по перекрестно реагирующему материалу — ПРМ+. Эти образцы показывают, что мутация обусловила синтез белка, лишенного каталитической активности, но сохранившего антигенную специфичность. Иные метаболические нарушения, характеризующиеся полной ферментной недостаточностью, такие как недостаточность мышечной фосфорилазы или хворь фон Виллебранда, являются ПРМ–; это указывает либо на полное неименье синтеза нужного белка, либо на столь глубокие изменения продукта гена, что он оказывается лишенным как каталитической, так и антигенной функции.
Большинство врожденных нарушений метаболизма характеризуется не полной, а частичной утратой активности белков. Частичная недостаточность может определяться рядом механизмов. Во-первых, она может отражать снижение скорости синтеза нормальных или дефектных молекул фермента. Во-вторых, она может быть связана с ускоренным распадом структурно измененного фермента. В-третьих, сниженная активность может быть обусловлена меньшим сродством активного фермента к субстрату или кофактору. В-четвертых, для олигомерных ферментов сниженная активность может определяться нарушением взаимодействия одинаковых или разных субъединиц. В-пятых, для ферментов, присутствующих в тканях не в одной, а в нескольких изоформах, сниженная активность может быть обусловлена избирательным неимением одной из этих форм. Среди потомственных нарушений размена веществ можно выделить любой из перечисленных механизмов. Больше того, одни и те же фенотипические проявления могут обусловливаться различными механизмами. Например, одни варианты Г-6-ФД обнаруживают повышенную лабильность, иные — аномальное сродство к субстрату, а третьи — нарушенное образование олигомера. Сходственные нарушения связаны с различными структурными аномалиями одной и той же полипептидной цепи.
Последствия транспортных или ферментативных нарушений
Значение генетического недостатка для метаболизма клетки и состояния организма зависит от роли мутантного белка в размене веществ и тяжести недостатка. Как уже упоминалось, большинство врожденных «ошибок»— результат недостатка внутриклеточных ферментов или процессов мембранного транспорта. Поскольку сходственного рода мутации часто обсуждаются далее, целесообразно очертить вероятные последствия нарушения транспортных или ферментативных процессов в обобщенном виде. Образцом может служить схематическая последовательность реакций, представленная на рис.305-1. Литерами А, В, С, D, Fи Gобозначены субстраты или продукты ряда ферментативных реакций, а та, ЕАВ, ЕВС
Рис.305-1. Схематическое изображение метаболического пути, включающего в себя систему транспорта (Тд), ферменты, альтернативные реакции и регуляцию по принципу обратной связи (по Rosenberg).
А, В, С, D—субстраты и продукты главного пути; F, G—продукты малого пути, та — транспортная система для А; ЕАВ ЕВС и ecd—ферменты, катализирующие превращение А в В,.В в С и С в D. и ecd— специфические транспортные системы или ферменты, катализирующие отдельные реакции этого ряда. Основной путь включает в себя превращение А в D через интермедиаты В и С;F и G — это продукты альтернативного пути метаболизма. Стрелка от D к ЕAB отражает отрицательную обратную связь между окончательным продуктом последовательности реакций и первым ферментом этого пути. В последующем будут по возможности приводиться образцы конкретных врожденных «ошибок», иллюстрирующие специфические последствия нарушения транспорта или ферментативных реакций.
Недостаточность предшественника. Если дефект локализуется на уровне та, т. е. в рецепторной или транспортной системе, переносящей А в клетку, то внутриклеточная концентрация А может оказаться слишком малой, чтобы насытить ЕAB субстратом. Это могло бы замедлять всю последовательность реакций и приводить к недостаточному образованию В, С и D. При хвори Хартнупа (см. гл.308) нарушается транспорт триптофана в кишечнике. Эта транспортная аномалия имеет серьезные химические и клинические последствия, поскольку триптофан внутри клетки превращается в никотинамид. У больных с этой патологией могут наступить мозжечковая атаксия и развиться временная или постоянная деменция из-за недостаточности никотинамида, если они дополнительно не получают ниацин с едой. Сходственно этому, у больных с врожденным нарушением всасывания витамина B12в кишечнике развивается мегалобластическая анемия, если им не вводить витамин парентерально. Недостаточность предшественника или субстрата может иметь место и в случае нарушения на уровне циркулирующего белка, переносящего вещество А в крови и доставляющего его к поверхности клетки.
Накопление предшественника.Рассмотрим эффект сниженной активности одного из внутриклеточных ферментов (еаb, ЕBC или ЕCD). Этот дефект мог бы приводить к накоплению внутри и вне клетки ближайших или отдаленных предшественников реакции. Если нарушен ЕAB, накапливается только А. Эта ситуация иллюстрируется резким увеличением количества лизосомного глюкоцереброзида при хвори Гоше (см. гл.316) и концентрации галактозы в крови при недостаточности галактокиназы (см. гл.314). Нарушение ЕBC может приводить к накоплению как А, так и В, а нарушение ecd— к накоплению А, В и С. При гомоцистинурии вследствие недостаточности цистатионинсинтазы накапливается не только гомоцистин — ближайший предшественник заблокированной реакции, но и метионин —отдаленный ее предшественник (см. гл.306).
Использование альтернативных путей.Если из-за недостаточности Едв нарушено превращение А в В, то А будет не только накапливаться, но и ускоренно превращаться по обычно минорному альтернативному пути в F и G. Великолепным образцом сходственной ситуации может служить фенилкетонурия. Неименье активности гидроксилазы фенилаланина приводит к резкой гиперпродукции и экскреции фенилпировиноградной, фенилуксусной и фенилмолочной кислот, т. е. соединений, в норме в крови, и моче не определяемых (см. гл.306). Если продукты альтернативных путей метаболизма, накапливаясь, служат помехой нормальным клеточным процессам, то усиление этих путей приобретает главное физиологическое значение.
Дефицит продукта. Если физиологически активным продуктом гипотетической последовательности реакций служит D, то блокада любого этапа (от А до D) приведет к недостаточному синтезу D. Тироксин в щитовидной железе образуется именно через такую серию реакций, начиная с транспорта йодида в железу с его последующим окислением и органификацией. К зобному кретинизму, обусловленному нарушением синтеза тироксина, приводит несколько ферментных нарушений. Сходственно этому, у ряда больных с врожденной гиперплазией надпочечников на почве нарушения гидроксилирования 21-го углеродного атома стероидного ядра нарушается продукция альдостерона, что приводит к утрате соли через почки и гипонатриемическим кризам. Недостаточный синтез продукта может сопровождаться чрезмерным образованием предшественников из-за выпадения механизма регуляции по принципу обратной связи, что происходит при острой интермиттирующей порфирии (D®ЕAB).
Избыток продукта. Как можно видеть на рис.305-1, окончательный продукт ряда реакций — D — регулирует активность ЕAB— первого фермента этого пути биосинтеза. Нарушение регуляции по принципу обратной связи обнаруживается при нескольких врожденных «ошибках», но биохимические основы этого нарушения не совсем понятны. У некоторых больных с первичной подагрой избыточное образование уратов происходит приблизительно из-за дефектности первого фермента пути синтеза пуринов и неименья реакции этого фермента на обычные ингибиторы — гипоксантин и аденин. Нарушение регуляции по принципу обратной связи при врожденной гиперплазии надпочечников и врожденном зобном кретинизме обусловлено, возможно, иными биохимическими механизмами. При этих заболеваниях образование или секреция соответственно адренокортикотропного (АКТГ) и тиреотропного (ТТГ) гормонов не подавляется их обычными «серво»-регуляторами — кортизолом и тироксином, что приводит к гиперплазии и функциональным недостаткам в обеих железах-мишенях. Нарушение регуляции по принципу обратной связи — это не единственный механизм, обусловливающий излишек продукта. При заболеваниях, характеризующихся излишком фермента, таких как гиперурикемия, вызванная повышением активности фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (см. гл.309), излишек продукта обусловлен в главном ускорением превращения предшественника в продукт.
Генетическая гетерогенность
Определенный аномальный фенотип может быть обусловлен не одним, а несколькими генотипами. Генетическая гетерогенность — распространенный и важный феномен. В больнице представление о генетической гетерогенности имеет существенное значение для диагностики, лечения и медицинского консультирования. Выяснение механизмов гетерогенности заболевания необходимо и для понимания вероятных путей модификации генома человека. Гетерогенность устанавливают с подмогою трех подходов — клинического, биохимического и генетического (табл.305-1).
Клинические признаки. Безбиохимических или генетических данных часто невероятно решить, определяются ли маленькие различия клинических проявлений какого-либо метаболического нарушения у разных лиц различными мутациями или одной и той же мутацией, но модифицированной под воздействием иных генов и факторов окружающей среды. Однако сведения, полученные с подмогою биохимических подходов, могут подкреплять клиническое впечатление о гетерогенности. Например, при ювенильной хвори Гоше начала заболевания следует ждать в более раннем возрасте, а летального исхода — быстрее, чем при взрослой форме хвори, так как в первом случае мутантная глюкоцереброзидаза владеет меньшей каталитической активностью, чем во втором (см. гл.316). Понятно, что когда активность глюкоцереброзидазы сочиняет всего 3 % от нормы, содержание глюкоцереброзидов в тканях будет увеличиваться прытче, чем если активность фермента сочиняет 15 % от нормы. Сходным образом причина неименья помутнения роговицы при хвори Гунтера и ее помутнение при фенотипически сходной хвори Гурлер почти наверняка содержится в различии ферментных нарушений при этих заболеваниях: недостаточность идуронатсульфатазы при болезни Гунтера и недостаточности a-L-идуронидазыпри хвори Гурлер.
Таблица 305-1.-Критерии генетической гетерогенности
1.Клинические
Возраст начала
Тяжесть
Специфические особенности
2.Биохимические
Компоненты крови, мочи и спинномозговой жидкости
Активность ферментов
Характеристика белков
Гибридизация ДНК—РНК или ДНК—ДНК
3.Генетические
Вероятность комплементации
Способ наследования
Проявления у гетерозигот
Анализ сцепления
Комплементация в смешанной культуре клеток или в гетерокарионах
Биохимические подходы.Чаще всего первым указанием на гетерогенность заболевания служат результаты химических и биохимических исследований. Эти исследования различаются по задачам и сложности: от идентификации отдельных соединений в крови, моче или спинномозговой жидкости до проведения молекулярной гибридизации. Можно привести образцы нарушений, гетерогенность которых показана с подмогою каждого из четырех видов биохимических исследований, приведенных в табл.305-1. Так, синдром кетозной гипергликемии, характеризующийся эпизодическим кетоацидозом, непереносимостью белка и гипергликемией, как свидетельствуют результаты химических анализов крови и мочи, оказался присущим нескольким нарушениям размена органических кислот: a-метилацетоуксусной ацидемии, пропионовой ацидемии и метилмалоновой ацидемии. У больных из разных семей с врожденной несфероцитарной гемолитической анемией была определена недостаточность разных гликолитических ферментов в эритроцитах. Гетерогенность GM2-ганглиозидозов оставалась безызвестной до тех пор, пока лизосомные гексозаминидазы не были разделены на изоферменты А и В и не удалось порознь определить их активность у больных с хворями Тея —Сакса и Сандхоффа. Иной подход связан с непосредственным исследованием генов, а не их продуктов. Результаты экспериментов по молекулярной гибридизации ДНК и РНК доказали существование двух крупных видов b-талассемии: b°, которая характеризуется явным неимением мРНК b-глобина, и b+, для которой отличительны, желая и сниженные, но все же определенные уровни b-глобиновой мРНК. По мере увеличения количества доступных зондов к генам человека из все большего и большего числа локусов можно ждать бурного использования метода гибридизации ДНК —ДНК как способа выявления гетерогенности. Эти методы уже продемонстрировали свою полезность для доказательства гетерогенности a- и b-талассемий, синдрома Леша —Найхана, фенилкетонурии и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.
Генетические подходы.Для выявления гетерогенности главны и генетические методы (см. табл.305-1). Одно из наиболее ранних и убедительных доказательств гетерогенности было получено при обследовании брачной пары. Оба супруга страдали сердитой глухотой, наследуемой по аутосомно-рецессивному типу. Ни один из их детей не страдал глухотой, что определенно свидетельствует о различии и, по-видимому, неаллельности тех мутаций, которые вызывали глухоту у родителей. В ряде случаев о гетерогенности свидетельствовал различный способ наследования фенотипически сходных (или идентичных) нарушений. Например, хвори Гунтера и Гурлер были разделены на том основании, что первая наследовалась как сцепленный с Х-хромосомой признак, а вторая — как аутосомный рецессивный. Подобно этому в истиннее время знамениты по крайней мере три формы спастической диплегии: одна наследуется как аутосомный доминантный, вторая — как аутосомный рецессивный, а третья — как сцепленный с Х-хромосомой признак. В нескольких случаях гетерогенность была впервые установлена по рецессивному фенотипу у облигатных гетерозигот. Например, о гетерогенности цистинурии свидетельствовал тот факт, что все облигатные гетерозиготы, члены одной семьи, экскретировали увеличенное количество цистина и лизина, тогда как анализ мочи облигатных гетерозигот, членов иных семей, не обнаруживал отклонений от нормы. Четвертым генетическим способом обнаружения гетерогенности служит анализ сцепления. Эти исследования позволили разделить потомственный эллиптоцитоз на две формы, одна из которых узко сцеплена с Rh-локусом группы крови, а иная — не сцеплена. Наконец, гетерогенность устанавливают с подмогою комплементационного анализа. Общая стратегия этих исследований проста. Фибробласты двух больных возделывают в одной и той же емкости или соединяют в гетерокарионы. Если аномальный фенотип, свойственный обеим клеточным чертам, сохраняется в культуре, то считается, что у того и иного больного дефект идентичен. Если же в смешанной культуре происходит коррекция, то дефекты в исходных чертах обязаны быть различными. Этот подход был использован для выявления гетерогенности широкого спектра нарушений, включая мукополисахаридозы, См2-ганглиозидозы, метилмалоновые ацидемии, пропионовые ацидемии, пигмент^ ную ксеродерму и экскрецию увеличенного количества кетокислот с разветвленной цепью. Теоретически положительные результаты комплементационных тестов могли бы обусловливаться любым из двух механизмов: межгенной комплементацией, в которой участвуют два разных локуса, или межаллельной комплементацией, при которой две различные мутации в одном и том же локусе оказываются обоюдно корригирующими. В большинстве случаев при положительном тесте на комплементацию имеет место, возможно, межгенный механизм.
Компаунд-гетерозиготы.Некоторые личика с этим метаболическим нарушением представляют собой компаунд-гетеро-, а не правильные гомозиготы. Компаунд-гетерозиготами именуют лиц, получивших различные, а не идентичные мутантные аллели определенного локуса от каждого родителя. Первыми идентифицированными компаунд-гетерозиготами были личика с хворью гемоглобина SC. Они наследуют ген гемоглобина Sот одного из родителей и ген гемоглобина С от иного. Эти больные владеют двойной порцией мутации по синтезу b-глобиновой цепи, и поэтому у них не образуются нормальные b-цепи. Клинически и химически они отличаются от правильных SS- или СС-гомозигот. Компаунд-гетерозиготы выявлены также среди больных с цистинурией, иминоглицинурией, недостаточностью галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы,L-идуронидазы, метилмалонил-КоА-мутазы и цистатионинсинтетазы. У некоторых, но не у всех компаунд-гетерозигот тяжесть состояния не уступает таковой у правильных гомозигот, что зависит от природы наследуемых мутантных аллелей.
Диагностические методы и объекты исследования
Физиологические жидкости.Большинство сведений о врожденных «ошибках» метаболизма и методах их выявления было получено в результате химических исследований крови или мочи, позволивших обнаружить специфические биохимические нарушения и во многих случаях открыть пути к изучению ферментов и выяснению конкретного недостатка. Они дали также возможность скрининга крупных популяций, облегчив тем самым выявление больных еще до появления у них явных клинических симптомов. Использование методов скрининга по крови и моче позволило обнаружить гетерозиготных носителей многих заболеваний. Эти методы часто подсобляют также проследить эффекты некоторых диетических и лекарственных средств или заместительной терапии.
Анализ тканей.Определение ферментов и биохимические исследования тканей человека, полученных маршрутом биопсии, позволили обнаружить специфические ферментные нарушения более чем при 100 метаболических аномалиях. При таких заболеваниях, как потомственный сфероцитоз, цистинурия и синдром нарушения всасывания глюкозы — галактозы, invitroбыли выявлены и нарушения мембранного транспорта. Эти исследования в прибавленье к доказательствам аномальности продуктов отдельных генов часто дозволяют идентифицировать биохимическую и генетическую гетерогенность, свойственную врожденным «ошибкам» метаболизма.
Исследования тканей не годятся для популяционных обзоров и оказываются наиболее полезными, если сочетаются с выявлением изменений в крови и моче.
Клеточные культуры.Существенный вклад в биохимию и генетику врожденных метаболических аномалий внесли также исследования на растущих в тканевой культуре фибробластах человека. В некоторых случаях (акаталазия, галактоземия, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, хворь накопления гликогена II типа, экскреция с мочой повышенного количества кетокислот с разветвленной цепью или оротовой кислоты) ферментные нарушения, ранее выявленные в иных тканях, были подтверждены на культуре фибробластов. При цитруллинемии и хвори Рефсума специфические ферментные аномалии вначале были обнаружены именно в фибробластах, а при синдроме Леша —Найхана нарушение активности гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы было выявлено одновременно в эритроцитах, лейкоцитах и возделываемых фибробластах. Имеют значение и аномалии, определяемые в клетках гетерозиготных носителей. Например, исследование облигатных гетерозигот по ряду сцепленных с Х-хромосомой признаков позволило получить подтверждение справедливости гипотезы Лиона.
Анализ ДНК.Использование методики блот-гибридизации ДНК —ДНК для диагностики потомственных метаболических нарушений появилось наиболее главным вариантом применения технологии рекомбинантной ДНК в медицине (см. гл.58). Этот подход основывается на выделении ДНК из легко доступных тканей, например лейкоцитов периферической крови, возделываемых фибробластов или клеток амниотической жидкости. После расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеазами и определения размеров полученных фрагментов с подмогою гель-электрофореза проводят реакцию с мечеными зондами к специфическим генам из конкретных локусов, ответственным за конкретные нарушения. Если молекулярный дефект, лежащий в основе нарушения, точно известен, как, например, при серповидно-клеточной анемии или Z-варианте a1-антитрипсина, то можно подобрать взыскательно определенные олигонуклеотидные зонды. В иных случаях диагностика исполняется легче маршрутом регистрации полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, подразделяемых на семейства и служащих полезными маркерами хвори (см. гл.58). Этот подход использован для диагностики хвори Гентингтона, фенилкетонурии, цитруллинемии, синдрома Леша —Найхана и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.
Выявление гетерозигот.Выявление гетерозиготных носителей двояко влияет на изучение врожденных недостатков. Во-первых, оно наглядно подтверждает рецессивность наследования заболевания самостоятельно от того, является ли мутация аутосомной или сцепленной с Х-хромосомой. Во-вторых, идентификация гетерозиготных носителей в одной семье дозволяет получить главные сведения для генетического консультирования ее членов. При заболеваниях, при которых у носителей могут появиться клинические признаки (т. е. при доминантно наследуемых дефектах, таких как острая перемежающаяся порфирия или семейная гиперхолестеринемия), выявление гетерозигот имеет непосредственное клиническое значение.
Гетерозигот можно идентифицировать с подмогою многих методов, используемых для выявления недостатков у больных. В некоторых случаях для выявления носителя достаточно применить методы скрининга проб крови или мочи. В иных полезными оказываются ферментативные методы. При ряде заболеваний анализ крови или мочи не дозволяет разграничить здоровых лиц и гетерозиготных носителей, но заключительных подсобляют выявить пероральные или парентеральные нагрузки предшественником в цепи нарушенной химической реакции. Так, гетерозиготы по галактоземии и фенилкетонурии реагируют на пероральную нагрузку соответственно галактозой и фенилаланином более высоким уровнем их в плазме по сравнению со здоровыми. Носители ряда заболеваний выявляются с подмогою ферментативн